El objetivo del estudio es comparar las diferentes eficacias entre antibióticos naturales y sintéticos. Para ello, se aislaron e identificaron diferentes bacterias (Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Bacillus cereus) con ayuda de diferentes medios y pruebas (eosina azul de metileno, sal y manitol, tinción gram, etc…). Una vez identificadas las bacterias se cultivaron diversos hongos de los que se extrajo la fase orgánica que debería contener los antibióticos. Finalmente se sembraron las bacterias en diversas placas, donde se realizaron antibiogramas con antibióticos sintéticos (penicilina G, ácido nalidíxico, cefotaxima y fosfomicina) y aceites esenciales (árbol de té, romero, salvia y eucalipto), y tubos donde se realizaron antibiogramas con extractos de la fase orgánica de los hongos (un Aspergillus y dos del género Penicillium). Posterior al cultivo simultáneo de las bacterias con los extractos de los hongos en los tubos, se sembraron placas de Mueller Hinton para comprobar su efectividad. Los resultados de los antibióticos sintéticos fueron los esperados según la acción que tiene cada uno, a excepción del Staphylococcus aureus que era multirresistente. Entre los resultados de los aceites esenciales, cabe destacar el árbol de té, que fue el que mayor eficacia tuvo. En cuanto a los extractos de hongos, se observó inhibición con el extracto 2 en las dos bacterias gram positivas y con el extracto 1 solo en Bacillus cereus. Se concluyó que los antibióticos sintéticos tienen mayor eficacia frente a los aceites esenciales y los extractos de hongo. Respecto a estos dos últimos se observó mayor eficacia con los extractos orgánicos de hongos que con los aceites esenciales.   Introducción

Uno de los grandes problemas actuales en la microbiología es descubrir nuevos antibióticos. Se creía que se tendría otra época dorada con la actual tecnología basada en genómica y proteómica, pero no ha sido así. Los antibióticos son medicamentos que combaten infecciones bacterianas. El primero del que dispuso el ser humano se obtuvo gracias a Alexander Fleming, que a través del hongo Penicillium aisló la penicilina. Por este descubrimiento Fleming ganó un premio Nobel de Medicina en el año 1945. Existen dos tipos de antibióticos, los naturales y los sintéticos. Los naturales son todas aquellas sustancias que tienen actividad antimicrobiana de forma natural. Dentro de estos se clasifican: los aceites esenciales, estos no tienen como principal misión la inhibición bacteriana, sino que suelen usarse para aromatizar, para tratamientos estéticos, etc… Sin embargo, muchos aceites contienen principios que pueden actuar con función antimicrobiana1. Otro tipo de antibiótico natural es el producido por los hongos. Algunas especies de hongos como Penicillium yAspergillus pueden producir betalactámicos, entre los cuales están las penicilinas y cefalosporinas que son moléculas para combatir a las bacterias, lo usan como mecanismo de defensa. Estas moléculas son las que hoy llamamos antibióticos y a partir de las cuales se han desarrollado los antibióticos que producen las farmacéuticas y que hoy clasificamos como sintéticos. Durante una de las prácticas de laboratorio en IFP Roger de Llúria, en la que se realizó cultivos bacterianos, se observó que uno de ellos se contaminó por el crecimiento de un hongo, y se percibió que alrededor de este no había crecimiento bacteriano, y que por tanto el hongo había creado algún tipo de antibiótico contra dicha bacteria (figura 1). Esto recuerda a los antibiogramas o al propio experimento de Fleming y fue así como surgió este proyecto.

Figura 1 El objetivo del artículo es comparar las diferencias bacteriostáticas de antibióticos naturales como extractos orgánicos de hongos y aceites esenciales, y antibióticos sintetizados en laboratorios farmacéuticos.

La hipótesis es que la eficacia de los antibióticos sintéticos es mucho mayor al resto. Respecto a los extractos de hongos y los aceites, se cree que harán más inhibición los aceites ya que estarán concentrados, mientras que extraer los antibióticos de los hongos es un proceso complicado donde no se controla la cantidad de agente antimicrobiano. Materiales y métodos Materiales Este estudio se ha realizado en las instalaciones del IFP Roger de Llúria entre los meses de febrero y abril. Medios de cultivo: Sabouraud2 (crecimiento micótico), Mueller- Hinton3 (realización de antibiogramas), Eosina Azul de Metileno4 (diferenciación de E. coli),Sal y Manitol5 (diferenciación de S. aureus), MRSA6 (detección de S. aureus multirresistente), Agua de Peptona7 (mantenimiento bacteriano). La preparación de todos los medios se hizo según las indicaciones de la casa comercial Diagnostici Liofilchem. Antibióticos: Fosfomicina (FOS, 50ug), de amplio espectro; cefotaxima (CTX, 30ug), de amplio espectro; penicillina G (P, 10IU), contra bacterias gram positivas; y ácido nalidíxico (NA, 30ug), contra bacterias gram negativas. La presentación de todos los antibióticos es en disco. La casa comercial es Diagnostici Liofilchem Aceites esenciales:

Árbol de té, romero, salvia y eucalipto de la casa comercial Sol Natural 7. Otros: Perforadora, papel de filtro, ácido clorhídrico, etanol 100%, agua destilada, tinción gram (cristal de violeta, lugol, decolorante y safranina). Método: Aislamiento de bacterias Las bacterias utilizadas fueron dos gram positivas, Staphylococcus aureus (coco) y Bacillus cereus (bacilo), y un gram negativoEscherichia coli (bacilo). El Staphylococcus aureus, provenía de la muestra nasal de un compañero. La muestra se recogió con un hisopo y se sembró un sal y manitol en condiciones de esterilidad. La apariencia amarilla de las colonias en el sal y manitol confirmó que se trataba deStaphylococcus aureus (también se le hizo una tinción gram según el método estandarizado). El Escherichia coli fue aprovechado de una práctica de muestra vaginal de una compañera. Fue aislado y cultivado en agua de peptona a partir de una Eosina azul de metileno. El aspecto verde metálico de las colonias en el medio confirmaba que se trataba deEscherichia coli. Respecto al Bacillus cereus, lo proporcionó el centro. Se hizo una tinción gram que confirmó que era un bacilo gram positivo. Para la conservación de las tres bacterias, se cultivaron en agua de peptona. Aislamiento de hongos Sabiendo que se pueden encontrar esporas de hongos en casi cualquier lugar, se decidió recoger hongos ambientales y crecidos en alimentos. Para ello se dejó durante toda una noche placas de Sabouraud en el lavabo y en una de las aulas del instituto y además se hizo una recogida de hongos crecidos en yogur, mandarina y tomate. De esta recogida se obtuvieron un total de 11 hongos distintos, 8 especímenes ambientales y 3 crecidos en los alimentos, que se fueron manteniendo a lo largo de las semanas, aumentando la cantidad de estos sembrándolos en medios de Sabouraud, para finalmente seleccionar 3 hongos que serían utilizados para la extracción. La identificación se realizó mediante impronta del hongo y su previa visualización al microscopio, gracias a la ayuda del profesorado. Identificamos el hongo al que nos referiremos como “hongo 2”, de origen ambiental, como un espécimen del género Aspergillus, mientras que otros dos, nombrados como “hongo 1” y “hongo 3”, obtenidos del crecimiento en un yogur y un tomate respectivamente, se identificaron como especímenes del género Penicillium, que eran precisamente los géneros que se buscaban, ya que los principales hongos productores de antibióticosbetalactámicos (penicilinas y cefalosporinas) pertenecen a los géneros Penicillium y Aspergillus (tabla 1).

Tabla 1 Extracción de fase orgánica de hongos La extracción de los antibióticos se basó en el protocolo del artículo “Antimicrobial activity of crude extracts prepared from fungal mycelia” 9. No obstante, se hicieron algunas modificaciones del procedimiento, de acuerdo con las instalaciones y los recursos del laboratorio. Como ya se ha comentado anteriormente, lo que se hizo fue cultivar durante 4-5 semanas los hongos en placas de Sabouraud. De los 3 hongos seleccionados para la extracción se cultivaron 6 placas para cada uno. Tras su crecimiento, rascamos las placas con una cuchara para extraer la máxima cantidad posible. Del hongo 1 obtuvimos 2,2 g. Del hongo 2 2,83g. Del hongo 3 1,82g. Se preparó una disolución de etanol al 80% al 0,2M de HCl, y se repartió en tres recipientes. En esta disolución se disolvieron los diferentes hongos. Según el artículo son necesarios 200 ml de disolución por cada 5 gramos de hongo. A partir de las cantidades obtenidas se hicieron los pertinentes cálculos. Estas tres soluciones se dejaron 24 horas en movimiento y posteriormente se dejaron evaporar con una fuente de calor. Los extractos obtenidos se centrifugaron 2 veces, primero con etanol y después con agua destilada. En cada centrifugación se recogió el sobrenadante. En el sobrenadante quedaría la fase orgánica extraída de los hongos. Aquí es donde se espera que esté el antibiótico que podría producir el hongo. En cambio, en el pellet de las centrifugaciones, se encontrarían los restos de las micelas y otras sustancias sin interés para este experimento. Finalmente se juntaron los dos sobrenadantes de cada hongo, y quedaron 3 extractos.

Antibiogramas Se hicieron 3 tipos de antibiogramas: Por un lado, se hicieron unos con discos de antibióticos sintéticos, donde se utilizaron placas de Mueller-Hinton sembradas por inundación con las diferentes bacterias. Se emplearon un total de 4 antibióticos distintos por bacteria. Para diferenciar correctamente el resultado se utilizaron placas pequeñas, con un diámetro de 5 cm, donde se colocaron por separado cada antibiótico, teniendo así un total de 12 antibiogramas. El volumen sembrado fue de 25 μl, habiendo hecho previamente una dilución 1:1 con suero salino y el cultivo que se había preparado en agua de peptona de las diferentes bacterias. Por otro lado, se hicieron antibiogramas con aceites esenciales. Para ello se prepararon discos perforando papel de filtro en condiciones estériles. Posteriormente serían sumergidos directamente en los diferentes aceites esenciales, para luego realizar una siembra por inundación de las diferentes bacterias en las placas de Mueller-Hinton y colocar los discos impregnados de aceite de la misma forma que se haría con los antibióticos sintéticos. Se sembraron 4 placas individuales por bacteria, en total 12, cada una de ellas contenía un aceite esencial diferente. Para ello se realizó una dilución 1:1 de suero salino y el inóculo puro de las diferentes bacterias, el volumen sembrado por inundación serían 25 μl. Para el tercer tipo se usaron los 3 extractos de hongo, pero esta vez se hicieron en medio líquido. Para ello se prepararon diversos tubos con 5ml de agua de peptona donde se inocularon 10μl de las respectivas bacterias. A cada tubo se le añadieron concentraciones crecientes de cada extracto (150μl, 200μl, 250μl, 300μl, 350μl). Además, se prepararon 3 tubos control para cada antibiótico. En estos añadimos 5 ml de agua de peptona y 350μl de cada antibiótico en cada tubo, sin las bacterias. Estos inóculos se dejaron 24h en la estufa, para después sembrar en medios de cultivo y valorar la efectividad de los antibióticos en base al crecimiento de colonias.

Cultivos para la valoración de antibiogramas en medio líquido Solamente se realizó el cultivo de los tubos que podían llegar a causar mayor discrepancia al observar su turbidez, estos fueron los tubos con 250 μl, 300 μl y 350 μl de extracto. Resultados Antibiogramas antibióticos sintéticos: Para las siguientes bacterias se observó (gráfica 1): En Bacillus cereus los únicos antibióticos que mostraron sensibilidad fueron la penicilina y la cefotaxima. En Staphylococcus aureus solamente los antibióticos que mostraron sensibilidad fueron la cefotaxima y la fosfomicina. En Escherichia coli los antibióticos que exclusivamente mostraron sensibilidad fueron cefotaxima, fosfomicina y ácido nalidíxico (figura 2). Figura 2: Comparación de dos antibiogramas de E. coli. Antibiograma de la izquierda con penicilina G; no se observa inhibición; antibiograma de la derecha con cefotaxima; se observa inhibición.

Antibiograma aceites esenciales: Los halos de inhibición no se visualizaban de igual manera que en los de antibióticos sintéticos, estos no se formaban uniformemente por la forma en que difundieron los aceites. Por ello se realizó un análisis cualitativo dónde se valoraba el grado de inhibición: sensible, intermedio o resistente (gráfica 2). En Bacillus cereus se observó sensibilidad solamente en Romero y Árbol de té. En Staphylococcus aureus y Escherichia coli observamos sensibilidad únicamente en Árbol de té. (figura 3). Antibiograma con extracto de hongo en medio líquido: Los resultados obtenidos (tabla 2): En Bacillus cereus se observó inhibición en el extracto 1 en el volumen de 350 μl (figura 4) y en el extracto 2 con los volúmenes de 350 μl y 300 μl (figura 5). En S. aureus se observó inhibición en el extracto 2 en el volumen de 350 μl (figura 5). En E. coli no se observó inhibición en ningún caso (figura 5).El extracto 3 no hace inhibición en ninguno. Figura 4: Valoración de crecimiento de B. cereus con extracto 1. En este caso la única placa en la que el extracto 1 hizo inhibición.

Figura 4: Valoración de crecimiento de B. cereus con extracto 1. En este caso la única placa en la que el extracto 1 hizo inhibición.